• 蛋白活性實驗-SOD3活性蛋白

    實驗原理Superoxide Dismutase 3, Extracellular (SOD3),是SOD同工酶的一種。SOD3以Cu2+、Zn2+為輔基,屬于CuZn SOD,可以消除體內代謝產生的反應氧族,抵御內外環境中超氧離子的損傷。由于超氧陰離子自由基O2 - 壽命短,不穩定,不易直接測定SOD活性,而采用間接的方法。本實驗采用鄰苯三酚自氧化法來間接測定,SOD的活性。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化,生成有色中間產物,在325nm下吸光值增加,加入SOD酶后能抑制其自氧化的速率,從而間接測定SOD酶的活性。實驗試劑及儀器試劑:50mmol/L Tris-HCl,pH8.250mmol/L 鄰苯三酚......

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  • Caspase-3活性檢測

    實驗原理Caspase-3是一種蛋白酶,屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族,在細胞凋亡中起著不可替代的作用。caspase-3可以被多種因素活化,在CTL細胞的殺傷作用中,它既可被Fas/FasL途徑活化,也可以通過顆粒酶B途徑活化。顆粒酶B是CTL細胞顆粒中的一種絲氨酸酯酶,是哺乳動物中除caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶,它可以特異性剪切ICE家族蛋白酶催化亞單位C端的XXD序列,并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。Caspase-3能催化特異性底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)水解生成對硝基苯胺,通過......

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  • 谷胱甘肽巰基轉移酶(GSTp)活性檢測

    實驗原理:Glutathione S Transferase Pi (GSTp)谷胱甘肽巰基轉移酶是體內生物轉化最重要的Ⅱ相代謝酶之一,是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統。它能催化機體內有害極性化合物與谷胱甘肽結合,防止DNA損害,還可以由非酶結合方式將體內各種潛在毒性化學藥物從體內排出。GSTp能催化內源性谷胱甘肽與1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)結合形成2,4-二硝基苯-谷胱甘肽復合物,在340nm處有吸收峰。因此,測定產物生成量可反映GSTp的活性。試劑:100mM NaH2PO4 緩沖液,pH7.0200mM L-谷胱甘肽(還原型)100mM 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)實驗步驟......

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  • 免疫沉淀(Immunoprecipitation)實驗操作流程

    樣本裂解液的制備1. 細胞裂解液的制備1)收集細胞:將細胞懸液(懸浮細胞直接收集,貼壁細胞可以用細胞刮或者胰酶消化后收集)收集于離心管中,4℃ 1500rpm離心5min后收集細胞沉淀;用預冷的1×PBS洗滌細胞2次,收集細胞沉淀。2)裂解細胞:向細胞沉淀中加入提前預冷的裂解液(裂解液在臨用前加入蛋白酶抑制劑),用槍頭將細胞團塊吹散,放要床上冰上裂解30min(如果細胞溶解不完全,冰上短時超聲裂解1-2min)。3)4℃10000rpm離心10min,取適量上清測蛋白濃度,剩余上清根據需求分裝與1.5ml EP管中,置于-80℃冰箱保存。2. 組織樣本裂......

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  • CCK-8法細胞活性及細胞增殖檢測實驗流程

    一 實驗材料及試劑96孔細胞培養板、CO2培養箱、酒精燈、微量移液器、酶標儀、CCK-8試劑盒等。二 實驗步驟1.取生長狀態良好的細胞制備成一定濃度的細胞懸液,每孔100ul加入96孔細胞培養板中。通常細胞增殖實驗每孔加入2×103個/100ul 細胞,細胞毒性實驗每孔加入5×103個細胞/100ul (具體每孔所用的細胞的數目,需根據細胞的大小、細胞增殖速度的快慢等因素決定)。如果是貼壁細胞,需要37℃培養箱進行預培養2-4小時等細胞貼壁后再開展實驗,如果是懸浮細胞,不需要預培養。2.根據實驗需求,在培養孔中加入0-10ul待測樣本繼續培養適當時......

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  • 流式細胞術檢測細胞分子實驗步驟

    一、流式細胞術檢測細胞胞膜分子1.細胞重懸:細胞處理計數后,用細胞洗液(含2% BSA的PBS)重懸細胞,使細胞濃度為1×107/mL;2.對照設置:空白對照、同型對照、待測樣本每管取100uL上述重懸的細胞,使每管細胞數達到1×106/管;3.一抗孵育:空白對照管不加抗體,同型對照管和待測樣本管分別加入5-20uL同型抗體和靶標抗體(具體使用量參照說明書),充分混勻,至4℃孵育30min或冬季可至于室溫孵育30min,孵育期間每隔10min晃動一下反應管,使細胞和抗體充分反應;4.細胞清洗:加入適量細胞洗液,1000rpm離心5min,棄上清,反復洗滌2次......

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  • 競爭抑制ELISA實驗操作流程

    1、酶標板包被抗體流程:1.1按說明書推薦的比例稀釋包被抗體,或者設計預實驗用倍比稀釋的方式稀釋包被抗體,酶標孔中加100ul包被抗體包被。酶標板加上覆膜,4℃溫育過夜或37℃溫育2小時。1.2棄去孔內液體,每孔用350μL的洗滌液洗滌,浸泡1-2分鐘。在吸水紙上輕拍酶標板來移除孔內所有液體。此過程也可采用噴射瓶,多道移液器 或自動洗板機來完成。1.3每孔加入200ul封閉液封閉,37℃溫育1.5小時。1.4 棄去孔內液體,甩干,洗板1次,方法同步驟1.2。酶標板包被抗體完成。2、實驗流程2.1按說明書推薦的方法稀釋成不同濃度的標準品工作液......

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  • 競爭抑制ELISA試劑盒標曲擬合及樣本測算方法

    競爭抑制 ELISA ,其主要原理是將標本中的靶分子和一定量的靶分子標記物競爭與酶標板上固相抗體結合。 標本中靶分子量愈多,結合在酶標板上的靶分子標記物愈少,最后的顯色也愈淺,也就是說,顯色的深淺與樣本中靶分子含量成負相關。小分子類激素、小分子藥物等 ELISA 測定多用此法。這是因為小分子半抗原或多肽半抗原,缺乏兩個以上的抗體結合位點,無法形成雙抗體夾心結果,對用競爭抑制法定量檢測。如何分析檢測數據測算結果呢?在這里為大家推薦一種方法,用EXCEL 軟件即可完成結果測算。1、標準曲線擬合方法以云克隆公司的去甲......

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